剪切、復(fù)制、粘貼，消除不需要的基因片段，換上想要的基因片段，這就是基因組編輯技術(shù)，它猶如一把“基因剪刀”，被科學(xué)家應(yīng)用在各種動(dòng)植物的基因修復(fù)與改造之中，為醫(yī)學(xué)、健康、農(nóng)業(yè)等方面帶來(lái)了突破性的革命。

為了更精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)基因組編輯，近年來(lái)，科學(xué)家不斷探索更多方法發(fā)展基因組編輯技術(shù)。

中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究員高彩霞團(tuán)隊(duì)與李家洋院士團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)了高效設(shè)計(jì)pegRNA以及提高植物引導(dǎo)編輯效率的新策略，為實(shí)現(xiàn)植物基因組功能解析和作物精準(zhǔn)育種提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。相關(guān)研究成果于3月25日凌晨在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。

更精準(zhǔn)的“夢(mèng)想”

2019年10月，哈佛大學(xué)教授劉如謙（David Liu）團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了全新的基因組引導(dǎo)編輯技術(shù)（Prime Editing），該技術(shù)能夠在基因組的靶位點(diǎn)處實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的片段插入、刪除及堿基的任意替換，被稱為是“超越CRISPR”的重大突破。

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)由兩部分構(gòu)成：其一，是nCas9 (H840A)與工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase, RT）組成的融合蛋白；其二是包含PBS（Primer Binding Site）序列和RT模板（RT template）序列的pegRNA（Prime Editing Guide RNA）。

2020年，高彩霞團(tuán)隊(duì)擴(kuò)展了引導(dǎo)編輯技術(shù)的應(yīng)用，首次在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導(dǎo)編輯器（Plant Prime Editor, PPE），為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物精準(zhǔn)基因組編輯提供了技術(shù)支撐。

“目前版本的引導(dǎo)編輯器在植物中的工作效率依舊偏低，需要進(jìn)一步優(yōu)化?！备卟氏佳芯繂T告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》，“我們之前的研究發(fā)現(xiàn)植物的引導(dǎo)編輯效率很大程度上受到PBS序列和RT模板序列的影響，這暗示著，對(duì)pegRNA序列進(jìn)行合理設(shè)計(jì)對(duì)提高引導(dǎo)編輯效率有很大幫助?！?/p>

兩種新策略

如何提升引導(dǎo)編輯效率并快速獲取高效形式的pegRNA，是植物引導(dǎo)編輯技術(shù)亟需解決的問(wèn)題。

一開(kāi)始，研究人員設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選高效形式的pegRNA，并希望能找到一般性的規(guī)律， 然而，事與愿違。常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，限制了引導(dǎo)編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用。

研究人員另辟新路。

由于引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的PBS序列與非靶標(biāo)鏈結(jié)合是起始逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的重要條件，而熔解溫度（Melting Tempreture, Tm）決定了兩條鏈結(jié)合的緊密程度，因此，他們推測(cè)PBS的Tm值很有可能對(duì)引導(dǎo)系統(tǒng)的編輯效率有重要影響。

為驗(yàn)證推測(cè)正確與否，研究人員在18個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，當(dāng)PBS的Tm值為30℃左右時(shí)，引導(dǎo)編輯效率在多數(shù)水稻內(nèi)源位點(diǎn)上達(dá)到最高，并且隨著溫度的增高或降低均呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。這也驗(yàn)證了他們的猜想。

研究人員還設(shè)想，對(duì)一個(gè)DNA位點(diǎn)的正鏈和負(fù)鏈都各設(shè)計(jì)一個(gè)pegRNA，利用DNA兩條鏈之間存在反向互補(bǔ)序列，是否可能會(huì)同時(shí)“啟動(dòng)”細(xì)胞中的其它修復(fù)途徑，共同提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的編輯效率。

他們?cè)?5個(gè)水稻內(nèi)源位點(diǎn)測(cè)試了該策略，結(jié)果表明，該策略與分別遞送單個(gè)pegRNA的方法相比效率平均可以提升3.0倍。他們將該改進(jìn)策略命名為“雙pegRNA策略”。

另外，實(shí)驗(yàn)還表明，運(yùn)用SpG變體可以進(jìn)一步拓展雙pegRNA策略的編輯范圍。

建立新平臺(tái)

國(guó)際同行專家給出了高度評(píng)價(jià)，“鑒于引導(dǎo)編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，該工作將對(duì)基因組編輯領(lǐng)域內(nèi)產(chǎn)生很大影響。”

“pegRNA的設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜，如何建立一個(gè)平臺(tái)，幫助需要科研人員針對(duì)所需位點(diǎn)進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，幫助他們構(gòu)建高效的引導(dǎo)編輯策略，方便大家使用。在這方面李家洋老師團(tuán)隊(duì)非常有經(jīng)驗(yàn)?！备卟氏颊f(shuō)。

為此，基于上述兩個(gè)策略，研究人員開(kāi)發(fā)了植物pegRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站PlantPegDesigner（http://www.plantgenomeediting.net/）。

該網(wǎng)站可以提供一系列的參數(shù)供使用者根據(jù)需要進(jìn)行個(gè)性化選擇，并可以推薦完整的pegRNA選擇、設(shè)計(jì)與構(gòu)建方案，方便使用者快速篩選高活性pegRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與常規(guī)設(shè)計(jì)方案或其他pegRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站相比，該網(wǎng)站設(shè)計(jì)的pegRNA具有更高的編輯效率。

實(shí)現(xiàn)重要農(nóng)作物精準(zhǔn)基因組編輯對(duì)加快農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)程具有重要意義。下一步，研究團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)優(yōu)化策略，提升網(wǎng)站平臺(tái)，為作物品種改良等提供更高效精準(zhǔn)的新工具。

相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1038/s41587-021-00868-w

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圖：植物高效引導(dǎo)編輯設(shè)計(jì)策略。（a,b）PBS的Tm值指導(dǎo)pegRNA設(shè)計(jì)的示意圖及其對(duì)PPE在水稻中編輯效率的影響。（c,d）雙pegRNA策略的示意圖及其對(duì)PPE編輯效率的提升。（e）PlantPegDesigner在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站的工作流程。（課題組供圖）



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